一种鉴别氨基酸的新型阵列传感器

作者:   发布时间:2014/6/27 10:36:05   浏览次数:2272

一种鉴别氨基酸的新型阵列传感器

氨基酸是生物代谢过程中的重要物质，是构建细胞、修复组织的基础材料。氨基酸的快速识别对细胞代谢分析具有重要意义。目前，氨基酸检测分析方法有气相色谱( GC)、液相色谱( HPLC)和毛细管电泳(CE)等各种色谱法。这些方法虽然具有精确度高和检出限低的优点，但这些检测方法均需要借助大型仪器，同时样品前处理时间长，不利于样本的快速检测。受到哺乳动物味觉系统的启发，一种新型的检测分析技术近年来受到重视，即基于交叉响应原理的阵列传感器。目前，对于此类传感器的研究已经有相关报导，识别对象包括金属离子，有机小分子，肽类等。其识别原理如图1所示．该传感器由多个传感点构成，每个传感点对于分析对象呈现不同的响应度，综合所有传感点的信息构成了分析对象的识别图谱，从而区分和检测分析对象。传感点不必具有特异性，只需对于不同的分析对象有不同作用力，从而产生了针对分析物的识别模式。该研究构建了鉴别氨基酸的液体阵列传感器，对9种常见的氨基酸进行了识别，对氨基酸类化合物的快速识别进行了探索研究。
1试验部分
1.1试剂与仪器
9种氨基酸：谷氨酰胺( Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)，均为分析纯，购自Sigma - Aldrich公司。
7种染料：溴甲酚紫、溴酚红、亮黄、甲基紫、吖啶橙、间胺黄和孔雀绿，均为分析纯，购自Sipna - Aldrich公司。四磺酸基四苯基卟啉(TPPS4)（纯度为99%），购自美国FrontierScienti6c公司。
超纯水由MiUipore Direct-Q Water system（法国Molsheim公司）制备。Imark酶标仪（美国BIO-RAD公司）。
l.2试验过程
1 2.1试验样品的准备
试验以9种氨基酸为检测对象，包括谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸以及甲硫氨酸。9种氨基酸分别用超纯水定容至50mL，浓度均为375umol/L，备用。
1.2.2阵列构建与检测方法
液体阵列构建时，选用的传感物质不需进行特异性设计，但为了保证其交叉响应的特性和光谱信号的实现，传感物质的选择需要考虑以下2个方面：
(l)传感物质具有多个作用位点，易与分析物发生相互作用；
(2)具有生色基团，当传感物质与分析物进行结合时，会引起光谱变化。
该传感器构建前期进行了大量光谱学研究，经过试验筛选出7种染料与1种卟啉化合物，其化学结构与测定波长如图2所示。该传感器构建在96孔板上，其布局如图3所示。一列的8个孔构成一个阵列，相当于一个传感器。1块96孔板则相当于含有12个传感器，可以同时对12个样本进行分析。检测前，向每列的8个孔中分别加入1OO uL对应的传感物质S1-S8。分析检测时，向此8孔中同时加入1OOuL的分析样本，20℃下振荡10min，测定对应波长下的OD值。每个样本进行3个平行样测定，每个平行样的检测结果包含了8个光谱数据，所有样该实验数据组成了一个(9×3) x8维的矩阵，将这些原始光谱数据作为输入变量进行模式识别分析。

一种鉴别氨基酸的新型阵列传感器
2结果与讨论
2.1聚类分析
聚类分析（Hierarchical clusLer analysis，HCA）是一种常用的统计分析方法。利用聚类分析，由聚类图可以直观地判断所采用的液体阵列传感方法对于9种氨基酸的区分能力，同时聚类图还表示了不同类别氨基酸的相似程度。用欧氏距离定义样品之间的相似度，用组间连接来定义集群。利用SPSS软件对27次试验所获得的数据进行HCA分析，结果如图4所示。在HCA图上，9种氨基酸被完全分开，由此可见，所构建的液体传感阵列对于氨基酸具有强大的识别能力。由图4可见，当欧式距离为25时，9种氨基酸可以分成两大簇，其中赖氨酸和组氨酸形成一簇，而其他的7种氨基酸为一簇。从理化性质上分析，赖氨酸与组氨酸均为碱性氨基酸，且均为极性带正电氨基酸。而谷氨酸与这两种氨基酸的欧式距离最远，是因为谷氨酸为酸性氨基酸，且为极性带负电氨基酸。而缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸与丝氨酸形成一簇，这5种氨基酸分子均含有一个羧基和一个氨基，在酸碱度上表现为中性氨基酸。同时，分析这5种氨基酸的极性发现，缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸均为非极性氨基酸，而甘氨酸和丝氨酸虽然为极性氨基酸，但是这2种氨基酸均为极性不带电氨基酸。分析HCA图可知，9种氨基酸的区分主要是基于氨基酸之间的酸碱度与极性的不同，追溯到阵列构建上，传感阵列对于分析物酸碱度和极性的识别能力主要来源于所选择的敏感物质中包括了酸碱指示剂和极性指示剂。另外，卟啉等物质对于不同功能基团具有很好的识别效果，这可能也是阵列能够对酸碱度和极性相近的氨基酸进行区别的一个重要原因。
2.2 LDA判别分析
判别分析是在分类确定的条件下，根掘某一研究对象的各种特征值判别其类型归属问题的一种多变量统计分析方法。它按照一定的判别准则，建立—个或多个判别函数，用研究对象的大量资料确定判别函数中的待定系数，并计算判别指标。根据建立的判别函数判断未知样本的类型归属。利用判别分析可以从液体阵列上的反应指纹信息中提取2个或3个包含综合信息的函数，将这几个函数作为坐标就可以将指纹信息可视化为一张散点图（图5）。每个判别分析散点图上的点都代表了—个分析样品与阵列反应的识别结果：聚在一起表明这些点所代表的分析样品与阵列的识别反应模式相近，反之，点之间的距离越远则表明这些点所代表的分析样品与阵列的识别反应模式差别大。

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